HCP ELISA實(shí)驗(yàn)布板優(yōu)化指南：提升數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵
截至目前，ELISA方法仍是工藝監(jiān)測(cè)和產(chǎn)品批次放行中檢測(cè)并定量HCP的金標(biāo)準(zhǔn)。Cygnus提供HCP 檢測(cè)試劑盒已經(jīng)超過25年，開發(fā)了許多專利方法生產(chǎn)對(duì)HCP具有廣泛反應(yīng)性的抗體，目前提供超過32種不同的表達(dá)平臺(tái)的HCP ELISA檢測(cè)試劑盒。 Cygnus的ELISA試劑盒使用預(yù)包被板，檢測(cè)同時(shí)加入抗原與檢測(cè)抗體進(jìn)行孵育。HCP檢測(cè)實(shí)際上相當(dāng)復(fù)雜，主要依賴于能夠?qū)?shù)千種HCP產(chǎn)生反應(yīng)的HCP抗體，要使 ELISA檢測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確，針對(duì)抗原的捕獲和檢測(cè)抗體必須都要過量。只有在抗體過量的條件下，才能得到正斜率的劑量曲線，從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定量。因此，合理的孔板布局設(shè)置是一個(gè)很好的開始。Cygnus HCP ELISA檢測(cè)基本流程 一、HCP ELISA布板規(guī)范 1. 復(fù)孔要求 推薦采用三復(fù)孔設(shè)計(jì)，三個(gè)復(fù)孔是最有效的做法，可以發(fā)現(xiàn)并去除可能出現(xiàn)的異常值，在完成實(shí)驗(yàn)后做問題排查時(shí)能提供更多信息。需要注意的是，如果檢測(cè)樣品數(shù)量不支持設(shè)置三復(fù)孔，那么最少要設(shè)置雙復(fù)孔，沒有復(fù)孔的檢測(cè)是無效的。如果可以的話，最好對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照品設(shè)置三復(fù)孔。 2. 空白對(duì)照 不建議設(shè)置額外的空白對(duì)照，扣除空白對(duì)照不會(huì)改善實(shí)驗(yàn)結(jié)果，甚至還會(huì)導(dǎo)致CV值升高。詳情請(qǐng)參考《使用Cygnus ELISA試劑盒該如何設(shè)置空白對(duì)照？》。 3. 設(shè)置陽性對(duì)照。 使用處于標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照（低濃度標(biāo)準(zhǔn)品受靈敏度影響較大）。當(dāng)使用來自HCP標(biāo)準(zhǔn)品的陽性對(duì)照時(shí)，曲線中間的濃度點(diǎn)通常會(huì)提供最多的信息。 4. 設(shè)置陰性對(duì)照 使用樣品稀釋液作為空白對(duì)照，從而評(píng)估0濃度標(biāo)準(zhǔn)品與所使用的稀釋液之間是否存在顯著偏差。 5. 設(shè)置1-2個(gè)額外的HCP對(duì)照 可以使用工藝流程中的一個(gè)已經(jīng)過充分表征的在制品樣品作為額外的HCP對(duì)照。有富余孔的條件下，設(shè)置兩個(gè)稀釋度會(huì)比只有一個(gè)稀釋度效果更好。 6. 使用低結(jié)合板優(yōu)化加樣步驟 在向孔板加樣時(shí)，最重要的是要思考完成每一步驟需要多長(zhǎng)時(shí)間，每一步驟的移動(dòng)方向是什么。對(duì)于這種情況，預(yù)先將待檢樣品和酶標(biāo)二抗加入低結(jié)合板內(nèi)，然后再整個(gè)轉(zhuǎn)移到檢測(cè)孔板中，這樣能夠大幅減少將樣品添加到檢測(cè)板時(shí)造成的加樣誤差。 二、ELISA布板示例 樣品布板的最佳方式是將標(biāo)準(zhǔn)品置于板的左側(cè)，將對(duì)照品（陰性或陽性對(duì)照）置于板的右側(cè)，同時(shí)還要考慮需要設(shè)置的復(fù)孔數(shù)量，樣品稀釋梯度，以及在加樣和洗板時(shí)的移動(dòng)方向。將標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品分別置于板的兩側(cè)，確保可以從孔板的任意一側(cè)都能獲取相同的信息。這樣能夠清晰地反映出在加樣時(shí)或洗板過程中可能出現(xiàn)的任何操作失誤，而且通過改變這些孔在板內(nèi)的位置能夠更好地進(jìn)行問題排查。 三復(fù)孔布板推薦示意圖 5個(gè)樣品4個(gè)稀釋梯度，所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及對(duì)照品都設(shè)置三個(gè)復(fù)孔 雙復(fù)孔布板推薦示意圖 4個(gè)樣品和加標(biāo)控制品都設(shè)置4稀釋梯度，所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及對(duì)照品都設(shè)置雙復(fù)孔 未知濃度HCP樣品布板推薦示意圖 4個(gè)樣品8個(gè)稀釋梯度，以便收集未知HCP水平樣品的大部分信息。 更多布板示例文末獲取。 三、HCP ELISA布板常見問題排查及解決辦法 1. 加樣問題 在HCP ELISA檢測(cè)過程中，每2分鐘的靜態(tài)孵育相當(dāng)于1分鐘的震蕩孵育。也就是說，如果加樣耗費(fèi)了20分鐘，就相當(dāng)于最先加入的樣品比最后加入的樣品多孵育了10分鐘。假如震蕩孵育的時(shí)間為1個(gè)小時(shí)，而加樣就花費(fèi)了20分鐘，那么勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致前后加入的樣品結(jié)合效率有差異，結(jié)果表現(xiàn)為最先加入的樣品會(huì)得到偏高的OD值。因此，加樣的原則是要確保板內(nèi)所有孔的孵育時(shí)間盡可能一致。如果一次需要檢測(cè)的樣品數(shù)量較多，為了避免在加樣過程耗費(fèi)太多時(shí)間，我們建議先將樣品和酶標(biāo)抗體加入低結(jié)合板中，然后再用排槍快速轉(zhuǎn)移到檢測(cè)板內(nèi)。實(shí)踐證明，這種操作方法可以有效改善因加樣時(shí)間差而導(dǎo)致的結(jié)果異常問題。 2. 洗板問題 不合理的洗板操作也會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的異常，與加樣操作類似，HCP ELISA洗板需要遵循的核心原則就是交替方向洗板，也就是盡可能確保所有孔的總清洗時(shí)間一致。關(guān)于洗板操作的注意事項(xiàng)請(qǐng)參考《如何用正確的洗板方法解決ELISA檢測(cè)結(jié)果漂移的問題？》 四 常見錯(cuò)誤案例與改進(jìn)辦法 案例一 加樣緩慢造成的誤差 如果同一個(gè)樣品依次從A到H行，按照1到12列方向逐孔緩慢加樣，即使采用了正確的洗板方式，這種加樣方式也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。以下熱圖示例展示了如果將相同的樣品以緩慢的速度加入孔板會(huì)發(fā)生的情況。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1.000 0.976 0.952 0.928 0.904 0.880 0.856 0.832 0.808 0.784 0.760 0.736 B 0.997 0.973 0.949 0.925 0.901 0.877 0.853 0.829 0.805 0.781 0.757 0.733 C 0.994 0.970 0.946 0.922 0.898 0.874 0.850 0.826 0.802 0.778 0.754 0.730 D 0.991 0.967 0.943 0.919 0.895 0.871 0.847 0.823 0.799 0.775 0.751 0.727 E 0.988 0.964 0.940 0.916 0.892 0.868 0.844 0.820 0.796 0.772 0.748 0.724 F 0.985 0.961 0.937 0.913 0.889 0.865 0.841 0.817 0.793 0.769 0.745 0.721 G 0.982 0.958 0.934 0.910 0.886 0.862 0.838 0.814 0.790 0.766 0.742 0.718 H 0.979 0.955 0.931 0.907 0.883 0.859 0.835 0.811 0.787 0.763 0.739 0.715 改進(jìn)辦法：預(yù)先在低結(jié)合板中加入酶標(biāo)抗體和樣品，之后再用排槍將所有樣品快速轉(zhuǎn)移到檢測(cè)板中進(jìn)行孵育。這樣可以有效減少不同孔加樣的時(shí)間差，確保所有孔的孵育時(shí)間盡可能一致，進(jìn)而降低異常值出現(xiàn)的概率。 案例二 同一個(gè)方向洗板造成的誤差 如果4次洗板都是同一個(gè)方向加入洗液的話，也會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。以下熱圖示例展示了4次洗板都是用排槍按照1到12列加入洗液可能發(fā)生的情況。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0.670 0.700 0.730 0.760 0.790 0.820 0.850 0.880 0.910 0.940 0.970 1.000 B 0.670 0.700 0.730 0.760 0.790 0.820 0.850 0.880 0.910 0.940 0.970 1.000 C 0.670 0.700 0.730 0.760 0.790 0.820 0.850 0.880 0.910 0.940 0.970 1.000 D 0.670 0.700 0.730 0.760 0.790 0.820 0.850 0.880 0.910 0.940 0.970 1.000 E 0.670 0.700 0.730 0.760 0.790 0.820 0.850 0.880 0.910 0.940 0.970 1.000 F 0.670 0.700 0.730 0.760 0.790 0.820 0.850 0.880 0.910 0.940 0.970 1.000 G 0.670 0.700 0.730 0.760 0.790 0.820 0.850 0.880 0.910 0.940 0.970 1.000 H 0.670 0.700 0.730 0.760 0.790 0.820 0.850 0.880 0.910 0.940 0.970 1.000 改進(jìn)辦法：建議采用交替方向的方式洗板，也就是第1和3次洗板與第2和4次洗板要從相反的方向加入洗液。 五 HCP ELISA結(jié)果異常案例與問題排查 如下圖所示，該檢測(cè)結(jié)果樣品復(fù)孔之間出現(xiàn)自左向右的降低的趨勢(shì)，且孔板右側(cè)的陰性對(duì)照和陽性對(duì)照的OD值都比左側(cè)低。通過兩側(cè)陽性對(duì)照結(jié)果不一致可以判定此次實(shí)驗(yàn)是失敗的。此外，左側(cè)陰性對(duì)照復(fù)孔之間OD值的平均差異為0.01，而右側(cè)陰性對(duì)照的OD值則接近背景水平，因此還需更多信息來進(jìn)一步判斷問題來自加樣還是洗板。 綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)失敗的原因可能為：1、加樣太慢；2、洗板沒有交替方向的操作。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A STD 1 Sample 1 Dilution 1 Sample 3 Dilution 1 Sample 5 Dilution 1 B STD 2 Sample 1 Dilution 2 Sample 3 Dilution 2 Sample 5 Dilution 2 C STD 3 Sample 1 Dilution 3 Sample 3 Dilution 3 Sample 5 Dilution 3 D STD 4 Sample 1 Dilution 4 Sample 3 Dilution 4 Sample 5 Dilution 4 E STD 5 Sample 2 Dilution 1 Sample 4 Dilution 1 Negative Control (Diluent) F STD 6 Sample 2 Dilution 2 Sample 4 Dilution 2 Control Dilution 1(External HCP) G STD 7 Sample 2 Dilution 3 Sample 4 Dilution 3 Control Dilution 2 (External HCP) H STD 8 Sample 2 Dilution 4 Sample 4 Dilution 4 Postive Control (STD 5 repeat) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 2.500 2.450 2.400 1.200 1.150 1.100 2.000 1.950 1.900 1.700 1.650 1.600 B 1.200 1.150 1.100 0.600 0.550 0.500 1.000 0.950 0.900 0.850 0.800 0.750 C 0.600 0.550 0.500 0.300 0.280 0.260 0.500 0.480 0.460 0.425 0.405 0.385 D 0.300 0.250 0.200 0.150 0.140 0.130 0.250 0.240 0.230 0.212 0.202 0.192 E 0.150 0.130 0.110 1.400 1.350 1.300 0.125 0.115 0.105 0.005 0.005 0.005 F 0.075 0.065 0.055 0.700 0.650 0.600 0.550 0.500 0.450 0.230 0.225 0.220 G 0.038 0.033 0.028 0.350 0.330 0.310 0.290 0.270 0.250 0.115 0.095 0.075 H 0.015 0.010 0.005 0.175 0.165 0.155 0.145 0.135 0.125 0.090 0.080 0.070 總結(jié) ? 在ELISA實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)該合理規(guī)劃孔板布局：優(yōu)化的孔板布局能夠監(jiān)測(cè)關(guān)鍵性能指標(biāo)，并在出現(xiàn)問題時(shí)更快地進(jìn)行問題排查。更多布板示例請(qǐng)點(diǎn)擊這里獲取。 ? HCP ELISA的關(guān)鍵考慮因素包括：復(fù)孔設(shè)置、樣品稀釋梯度、加樣和洗板的操作、對(duì)照的設(shè)置。 ? 用低結(jié)合板來優(yōu)化加樣操作，可以最大程度減少OD值的偏差。 ? 切勿使用空白對(duì)照，這樣做會(huì)提高檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)。 相關(guān)產(chǎn)品推薦： 品名：Sample Treatment Plate （樣品處理板） 貨號(hào)：F402 規(guī)格：1 plate Cygnus Technologies, LLC.為生物技術(shù)和生物制藥行業(yè)提供產(chǎn)品和分析方法，旨在加速研發(fā)階段和提高產(chǎn)品質(zhì)量。Cygnus開發(fā)和生產(chǎn)的生物工藝殘留試劑盒，用于檢測(cè)超過50種不同表達(dá)系統(tǒng)的特異性雜質(zhì)。Cygnus作為專注于生物技術(shù)應(yīng)用免疫檢測(cè)的高靈敏度分析技術(shù)的專家，Cygnus的產(chǎn)品和服務(wù)已經(jīng)被幾乎所有主要的生物制藥公司使用超過25年。 北京西美杰科技有限公司作為Cygnus在中國(guó)總代理，與國(guó)內(nèi)眾多知名藥企，CRO/CMO企業(yè)建立了長(zhǎng)久穩(wěn)定的合作關(guān)系。多年來西美杰的產(chǎn)品及服務(wù)幫助許多企業(yè)加速R&D階段，提高藥物質(zhì)量、純度和安全，加速優(yōu)化研發(fā)工藝，減少產(chǎn)品上市時(shí)間，降低QC成本。如您對(duì)上述產(chǎn)品感興趣，歡迎致電西美杰客服熱線400-050-4006或者登陸網(wǎng)站atiwa.cn了解更多信息。
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